Техника определения группы крови

/ темы / 6 ПЕРЕЛИВАНИЕ КРОВИ И КРОВЕЗАМЕНИТЕЛЕЙ

Способы определения группы крови

Групповую принадлежность крови по системе АВ0 определяют с помощью реакции агглютинации. В настоящее время используют три способа определения групп крови по системе АВ0:

•  с помощью стандартных изогемагглютинирующих сывороток;

•  с помощью стандартных изогемагглютинирующих сывороток и стандартных эритроцитов (перекрёстный способ);

•  с помощью моноклональных антител (цоликлонов анти-А и анти-В).

Существует следующая общепринятая тактика при определении группы крови.

При плановом исследовании врач стационара определяет группу крови с помощью стандартных изогемагглютинирующих сывороток, или цоликлонов, после чего посылает кровь в серологическую лабораторию для проверки группы перекрёстным методом.

Группу крови считают определённой только в том случае, если лаборатория подтвердила данные, полученные врачом стационара. Если результаты исследований расходятся, оба исследования нужно повторить.

При необходимости определения группы крови в экстренном порядке (при кровотечении необходимо срочное переливание крови) врач стационара определяет группу крови сам (в лаборатории перепроверку выполняют, но постфактум). В таких случаях также используют реакции с изогемагглютинирующими сыворотками (или поликлонами), но при возможности целесообразно применение пе- рекрёстного метода.

Определение групп крови с помощью стандартных изогемагглютинирующих сывороток

Этот способ в настоящее время наиболее распространён в клинической и лабораторной практике.

Суть метода сводится к обнаружению в исследуемой крови групповых антигенов А и В с помощью стандартных изогемагглютинирующих сывороток. Для этого используют реакцию агглютинации. Постановку реакции проводят в помещении с хорошим освещением при температуре 15-25?С.

Необходимое оснащение

1. Стандартные изогемагглютинирующие сыворотки групп 0(I), A(II), В(III) и АВ(IV) двух различных серий. Сыворотки для определения групп крови изготавливают в специальных серологических ла- бораториях из донорской крови. Сыворотки хранят при температуре 4-8 ?С (в холодильнике). Срок годности сыворотки указан на этикете. Титр сыворотки (также указан на этикетке) должен быть не ниже 1:32 (для сыворотки В(Ш) - не ниже 1:16/32). Под титром сыворотки понимают то максимальное её разведение, при котором может наступать реакция агглютинации. Сыворотка должна быть прозрачной. Для удобства стандартные гемагглютинирующие сыворотки различных групп подкрашивают так, чтобы они имели определённый цвет: 0(I) - бесцветная, А(II) - синяя, В(III) - красная, АВ(IV) - ярко-жёлтая. Следует отметить, что указанные цвета сопутствуют всем этикеткам на препаратах крови, имеющих групповую принадлежность (кровь, эритроцитарная масса, плазма и др.).

2. Белые фарфоровые или эмалированные тарелки, или любые другие; пластинки со смачиваемой поверхностью, маркированные 0(I), А(П), В(Ш), AB(IV).

3. Изотонический раствор хлорида натрия.

4. Иглы, пипетки, стеклянные палочки (предметные стёкла).

Методика проведения реакции

1. Перед началом реакции подписывают тарелку (наносят фамилию и инициалы исследуемого), после чего на неё под соответствующие обозначения наносят стандартные изогемагглютинирующие сыворотки I, II и III групп в объёме 0,1 мл (капля около 1 см в диаметре). Во избе- жание ошибок наносят две серии сывороток каждой из групп, так как одна из серий может иметь низкую активность и не дать чёткой агглютинации. Всего получается шесть капель, образующих два ряда по три капли в следующем порядке слева направо: 0(I), А(П), В(Ш).

2. Кровь для исследования берут из пальца или из вены. Шесть капель исследуемой крови величиной приблизительно с булавочную головку (0,01 мл, маленькая капля) последовательно переносят сухой стеклянной палочкой на пластину в шесть точек, каждую - рядом с каплей стандартной сыворотки (количество исследуемой крови должно быть приблизительно в 10 раз меньше количества стандартной сыворотки, с которой её смешивают), потом их осторожно с помощью стеклянных палочек с закруглёнными краями перемешивают.

Возможна более простая методика: на тарелку наносят одну большую каплю крови, из которой её забирают уголком предметного стекла и переносят в каждую каплю сыворотки, аккуратно перемешивая с последней. При этом всякий раз кровь берут новым уголком стекла, следя за тем, чтобы капли не сливались.

3. После смешивания тарелку периодически покачивают.

Агглютинация начинается в течение первых 10-30 с, однако наблюдение следует обязательно вести до 5 мин ввиду возможности более поздней агглютинации, например с эритроцитами группы A₂(II).

4. В те капли, где произошла агглютинация, добавляют по одной капле изотонического раствора хлорида натрия, после чего оценивают результат реакции.

Трактовка результатов

Реакция агглютинации может быть положительной или отрицательной. При положительной реакции обычно в течение первых 10- 30 с в смеси появляются видимые невооружённым взглядом мелкие красные зёрнышки (агглютинаты), состоящие из склеенных эритроцитов. Мелкие зёрнышки постепенно сливаются в более крупные зёр- на, а иногда в хлопья неправильной формы. При этом сыворотка частично или полностью обесцвечивается. Положительная реакция может быть пескообразной или лепестковой (рис. 6-1).

Рис. 6-1. Виды агглютинации: а - агглютинации нет; б - пескообразная агглютинация; в - лепестковая агглютинация

При отрицательной реакции капля остаётся равномерно окрашенной в красный цвет, в ней не обнаруживают никаких зёрнышек (агглютинатов).

Результаты реакций в каплях с сыворотками одной и той же группы (двух серий) должны совпадать.

Принадлежность исследуемой крови к соответствующей группе определяют по наличию или отсутствию агглютинации при реакции с соответствующими сыворотками после наблюдения в течение 5 мин (табл. 6-2).

При этом следует отметить, что если сыворотки всех трёх групп дали положительную реакцию, это указывает на то, что испытуемая кровь содержит оба агглютиногена (А и В) и принадлежит к группе AB(IV). Однако в таких случаях для исключения неспецифической реакции агглютинации необходимо провести дополнительное контрольное исследование испытуемой крови со стандартной изогемагглютинирующей сывороткой группы AB(IV), не содержащей агглю-

Таблица 6-2. Оценка результатов реакции со стандартными изогемагглютинирующими сыворотками

тининов. Лишь отсутствие агглютинации в этой капле при наличии агглютинации в каплях, содержащих стандартные сыворотки групп 0(I), А(II) и В(III), позволяет считать реакцию специфической и отнести исследуемую кровь к группе АВ₀(IV).

Следует отметить, что при наличии в исследуемой крови слабого антигена А₂ реакция агглютинации с гемагглютинирующими сыворотками групп 0(I) и B(III) начинается позже (на 3-4-й мин).

Идентификацию подгрупп антигена А проводят в серологической лаборатории с помощью специальных экстрактов из семян Dolichos biflorus и Ulex Europeus. Первый из них агглютинирует эритроциты с антигеном А₁, но не реагирует с антигеном А₂, а второй - наоборот.

Определение групп крови перекрёстным способом

Способ наиболее часто используют в серологических лабораториях. Суть метода состоит в определении наличия или отсутствия в исследуемой крови групповых антигенов А и В с помощью стандартных изогемагглютинирующих сывороток, а также групповых антител α и β с помощью стандартных эритроцитов. Реакцию со стандартными сыворотками проводят описанным выше способом.

Реакцию со стандартными эритроцитами проводят следующим образом.

Необходимое оснащение

Оснащение для реакции со стандартными эритроцитами отличается тем, что для её проведения необходимы стандартные эритроци- ты трёх групп крови: 0(I), А(II), B(III). Стандартные эритроциты при- готавливают из крови доноров с заранее известной группой крови, хранят при 4-8 ?С. Срок годности 2-3 дня.

Методика проведения реакции

1. Кровь для исследования берут из вены в сухую пробирку, центрифугируют или оставляют в покое на 20-30 мин для получения сыворотки.

2. На маркированную тарелку пипеткой наносят три больших капли (0,1 мл) сыворотки исследуемой крови из пробирки, а рядом с ними - по одной маленькой капле (0,01 мл) стандартных эритроцитов групп.

3. Дальнейшие мероприятия проводят аналогично методу с использованием стандартных изогемагглютинирующих сывороток: соответствующие капли смешивают стеклянными палочками, планшет по- качивают, наблюдают в течение 5 мин, в капли с агглютинацией

Таблица 6-3. Оценка результатов определения группы крови перекрёстным способом

добавляют изотонический раствор хлорида натрия, после чего оценивают результат.

Трактовка результатов

Оценивают данные, полученные при обеих реакциях (со стандартными изогемагглютинирующими сыворотками и стандартными эритроцитами - табл. 6-3).

Особенность трактовки результатов реакции со стандартными эритроцитами - эритроциты группы 0(I) считают контрольными (в них нет антигенов, что делает принципиально невозможной специфическую реакцию агглютинации с любой сывороткой).

Результат перекрёстного способа считают достоверным, только если при оценке результатов реакции со стандартными изогемагглютинирующими сыворотками и со стандартными эритроцитами ответы о группе исследуемой крови совпадают. Если этого не происходит, обе реакции следует переделать.

Определение групп крови моноклональными антителами Необходимое оснащение

Для определения группы крови используют моноклональные антитела, для получения которых применяют гибридомную биотехнологию.

Гибридома - клеточный гибрид, образованный путём слияния клетки опухоли костного мозга (миеломы) с иммунным лимфоцитом, синтезирующим специфические моноклональные антитела. Гибридома приобретает свойства обоих «родителей»: способность к нео-

Таблица 6-4. Схема оценки результатов определения групп крови с помощью моноклональных антител (цоликлоны анти-А и анти-В)

граниченному росту, характерную для опухолевой клетки, и возможность синтезировать антитела, присущую иммунному лимфоциту.

Разработаны стандартные реагенты - моноклональные антитела: цоликлоны анти-А и анти-В, применяемые для определения агглютиногенов эритроцитов. Цоликлоны используют в виде лиофилизированного порошка красного (анти-А) или синего (анти-В) цвета, порошок разводят изотоническим раствором натрия хлорида непосредственно перед исследованием.

Техника проведения реакции

Цоликлоны анти-А и анти-В наносят на белый планшет по одной большой капле (0,1 мл) под соответствующими надписями: анти-А и анти-В. Рядом с ними наносят по одной маленькой капле (0,01 мл) исследуемой крови. После перемешивания составных частей за реакцией агглютинации наблюдают в течение 2-3 мин.

Трактовка результатов

Оценка результатов очень проста (табл. 6-4).

Методика определения группы крови с помощью цоликлонов позволяет отказаться от стандартных изогемагглютинирующих сыворо- ток, получаемых из донорской крови.

Возможные ошибки

Определение групповой принадлежности с помощью реакции агглютинации может сопровождаться ошибками, ведущими к неверной трактовке результатов. Все ошибки можно разделить на три группы:

•  низкое качество реагентов;

•  технические ошибки;

•  особенности исследуемой крови.

Низкое качество реагентов

Стандартные изогемагглютинирующие сыворотки и стандартные эритроциты могут иметь низкие агглютинабельные свойства, что при- водит к неверному толкованию результатов реакции. Во избежание подобных ошибок нужно следить за сроком годности, условиями хранения и внешним видом реагента (прозрачность сыворотки, отсутствие плёнок, хлопьев, запаха гниения и пр.).

Технические ошибки

Ошибки технического характера связаны с несоблюдением или недостаточно точным выполнением всех правил проведения реакции.

Несоблюдение внешних условий

Плохая освещённость мешает обнаружить агглютинацию или её отсутствие.

Повышение температуры выше 25 ?С резко замедляет реакцию.

При низкой температуре (ниже 15 ?С) может произойти неспецифическая агглютинация, независимо от состава агглютининов и агглютиногенов - так называемая холодовая панагглютинация (агглю- тинация возникает при реакциях с сыворотками всех групп крови). Это происходит из-за наличия в сыворотке особого холодового агглютинина, способного давать реакцию агглютинации только при низких температурах.

Неправильное проведение самой реакции

Нарушение расположения сывороток, соотношения сыворотки и крови, слияние соседних капель создают возможность неправильной интерпретации полученных результатов.

Ранняя оценка результатов также может привести к ошибке, особенно при наличии слабого антигена А₂, дающего позднюю агглютинацию.

Недобавление физиологического раствора. Несоблюдение этого простого правила (в капли, где произошла агглютинация, следует добавить изотонический раствор хлорида натрия) может привести к тому, что за специфическую агглютинацию принимают ложную (псевдоагглютинацию). Под термином «псевдоагглютинация» подразумевают способность эритроцитов склеиваться в «монетные столбики», или «кучки», с сохранением мембран, независимо от их агглютинабельных свойств. Границы между форменными элементами хорошо

видны под микроскопом, в отличие от истинной агглютинации, при которой происходит разрушение мембран эритроцитов. Добавление 1-2 капель изотонического раствора хлорида натрия позволяет дифференцировать истинную агглютинацию от ложной. Псевдоагглютинация расходится довольно быстро, в то время как истинная агглютинация сохраняется прежней или становится более выраженной.

Особенности исследуемой крови

Развитие неспецифической панагглютинации может быть связано не только с низкой температурой, но и с качествами самой крови.

Панагглютинацию при бактериальном заражении исследуемой крови в 1927 г. описал Томсен. Этот феномен (феномен Томсена) характеризуется агглютинацией крови с сыворотками всех групп и сывороткой собственной крови.

Сущность явления заключается в том, что сыворотка при комнатной температуре даёт агглютинацию со всеми эритроцитами, даже со своими собственными (аутоагглютинация), а эритроциты в то же время дают агглютинацию со всеми сыворотками, даже с сыворотками группы AB(IV).

Подобное явление описано при различных заболеваниях: болезнях крови, спленомегалии, циррозе печени, инфекционных заболеваниях и т.д. Панагглютинацию крайне редко наблюдают и у здоровых людей. Панагглютинацию и аутоагглютинацию выявляют только при комнатной температуре; при температуре, близкой к температуре человеческого тела, этих явлений не происходит.

Во избежание ошибок необходимо не допускать определения группы крови при температуре ниже 15 ?С. Если при определении групповой принадлежности агглютинация происходит с сыворотками групп 0(I), A(II) и B(III) всегда следует проводить реакцию с сывороткой группы AB(IV). Только в том случае, если в этой капле не будет агглютинации, можно исключить панагглютинацию и отнести кровь к группе AB₀(IV). При наличии агглютинации с сывороткой AB(IV) необходимо подогреть кровь до 37 ?С и провести реакцию при этой температуре, при этом панагглютинация и аутоагглютинация исчезают.

При некоторых заболеваниях отмечают снижение агглютинабельности агглютиногенов эритроцитов (хронические инфекционные за- болевания, онкологические заболевания, болезни крови и др.). При этом так же, как и при наличии слабого антигена A₂, следует чётко соблюдать условия и время реакции.

Во всех случаях нечёткого или сомнительного результата необходимо повторное определение группы крови при помощи стандартных сывороток других серий, а также перекрёстным способом.

Определение резус-фактора Антигенная система резус-фактора

В 1940 г. К. Ландштейнер и А. Винер обнаружили в эритроцитах человека совершенно новый антиген, названный ими резус-фактором (Rh). Резус-фактор присутствует в крови 85% людей, а у 15% отсутствует.

Система антигенов резус представлена пятью основными антигенами: D, C, с, Е, e (ранее считали, что их шесть, но позже было доказано, что аллельного гена d не существует). C и с, а также Е и e - аллельные антигены. Каждая из хромосом несёт только три гена из пяти: D, С или с, Е или е.

Номенклатура Dd, Cc, Ее была предложена Р. Фишером и Р. Рейсом. Другая номенклатура (Rh-Hr) была введена А. Винером. Он обозначил шесть резус-антигенов следующим образом: Rh₀ (D), rh'(C), rh»(E), Hr_o(d), hr'(c), hr»(e).

Указанные пять антигенов резус (исключая антиген d) встречают в эритроцитах в виде одного из 18 возможных сочетаний (табл. 6-5). Фенотипически каждый человек содержит 5, 4 или 3 антигена резус в зависимости от количества генов, по которым он гомозиготен. Однако генотипическую формулу изображают шестью буквами, например, cDE/CDe, обозначающими три гена резус, унаследованных с хромосомой одного из родителей, три - с хромосомой другого.

Наиболее активен из всех антигенов Rh_o(D) - резус-фактор. В зависимости от его наличия или отсутствия кровь людей делят на резус-положительную (Rh+) и резус-отрицательную (Rh-).

Иначе подходят к оценке резус-принадлежности доноров. Необходимо дополнительное исследование крови доноров по факторам Е и С. Резус-отрицательными могут быть только доноры, в крови которых отсутствуют все три антигена (D, С, Е). Такой подход к оценке резус-принадлежности доноров позволяет исключить возможность сенсибилизации реципиента к любому из трёх основных антигенов:

Rh_o(D), rh'(C), rh»(E).

В повседневной практике переливания крови ограничиваются определением у реципиента только антигена Rh_o(D).

Таблица 6-5. Aнтигенные группы системы резус-фактор (по M.A. Умно- вой, 1983)

Существует подтип этого антигена Du, отличающийся по структуре и количеству экспрессируемых молекул на строме эритроцитов. Иммуногенность антигена Du значительно снижена, и выявить его сложнее, чем резус-фактор. Подтип Du имеет существенное значение, так как приводит к синтезу особых антител. Они могут стать причиной развития резус-несовместимости крови донора и реципиента. При наличии Du кровь реципиента считают отрицательной, а кровь донора - положительной.

Aнтигены резус - липопротеиды. Они очень активны и способны вызывать образование иммунных антител. Резус-антитела, будучи иммунными (неполными, моновалентными, блокирующими), могут фиксироваться к резус-положительным эритроцитам, не вызывая их склеивания. Они агглютинируют эритроциты только в присутствии коллоидных растворов, протеолитических ферментов или под действием специально приготовленной антиглобулиновой преципитирующей сыворотки. Неполные антитела относят к иммуноглобулинам класса G.

Наличие резус-антигена выявляют у эмбриона начиная с 5-8-й нед, оно хорошо выражено на сроке гестации 3-4 мес. Существова-

ние антигенов системы резус в эритроцитах человека - физиологическое явление, антител к этим антигенам в организме людей с резус-положительными эритроцитами нет. Образование иммунных антител происходит при поступлении в организм человека чужеродного ему изоантигена. У сенсибилизированных людей с резус-отрицательными эритроцитами антитела анти-D содержатся не только в крови, но и в экссудате, транссудате, моче, слезе и других средах.

Способы определения резус-фактора

Все методы определения резус-фактора делят на способы, применяемые в клинической практике, и лабораторные способы.

Способы определения Rh₀(D) в клинической практике

В клинических условиях (в приёмном покое, хирургическом отделении, операционной), где нет специального лабораторного оборудования, используют экспресс-методы определения Rh_o(D) (D-фактора).

Экспресс-метод определения стандартным универсальным реагентом в пробирке без подогрева

Для исследования можно использовать свежую несвернувшуюся кровь, взятую из пальца (или вены) непосредственно перед исследованием, или консервированную кровь без предварительной обработки, а также эритроциты из пробирки после формирования сгустка и отстаивания сыворотки.

Методика проведения реакции. Исследование проводят в центрифужных пробирках объёмом не менее 10 мл. На дно пробирки вносят одну каплю стандартного универсального реагента, представляющего собой антирезусную сыворотку группы АВ(IV), разведённую 33% раствором декстрана (ср. мол. масса 50 000-70 000). Затем в неё добавляют одну каплю исследуемой крови (или эритроцитов). Круго- вым вращением пробирки содержимое размазывают по её внутренней поверхности таким образом, чтобы содержимое растеклось по стенкам. Это значительно ускоряет агглютинацию и делает её крупнолепестковой. Агглютинация на стенках пробирки наступает, как правило, в течение первой минуты, но для образования устойчивого комплекса антиген-антитело и чёткой агглютинации наблюдать следует не менее 3 мин. Затем для исключения неспецифической агрегации эритроцитов в пробирку добавляют 2-3 мл физиологического

раствора и перемешивают путём одно-двукратного перевертывания пробирки (без взбалтывания!).

Трактовка результатов. Наличие агглютинации (крупные хлопья на фоне просветлённой жидкости) указывает на резус-положительную принадлежность исследуемой крови. Отсутствие агглютинации (в пробирке гомогенно окрашенная розовая жидкость) свидетельствует о резус-отрицательной принадлежности исследуемой крови.

Лабораторные способы определения резус-фактора

Для определения резус-принадлежности крови больного в условиях лаборатории применяют четыре основных метода.

Метод агглютинации в солевой среде

Используют специальные сыворотки, содержащие полные антитела анти-резус. Эритроциты в виде 2% взвеси в изотоническом ра- створе хлорида натрия соединяют в пробирках с антирезусной сывороткой. Пробирки помещают на 1 ч в термостат при температуре 37 ?С, после чего осадок эритроцитов на дне пробирки рассматривают с помощью лупы и по его форме учитывают результат. При положительном результате (Rh+) осадок имеет характерный рисунок в виде нитей или зернистости. При отрицательном (Rh-) осадок размещается равномерным слоем и имеет вид правильно очерченного круга.

Метод агглютинации в присутствии желатина

B две пробирки помещают по 0,02-0,03 мл осадка исследуемых эритроцитов. Затем в первую пробирку добавляют 2 капли (0,1 мл) 10% раствора желатина и 2 капли (0,1 мл) анти-резусной сыворотки, во вторую (контрольную) пробирку - 2 капли (0,1 мл) 10% раствора желатина и 2 капли (0,1 мл) физиологического раствора.

Содержимое осторожно перемешивают. Затем пробирки инкубируют в термостате при температуре 45-48 ?С в течение 30 мин, после чего добавляют 5-8 мл физиологического раствора и переворачивают пробирки 1-2 раза для перемешивания.

Результат учитывают, просматривая пробирки на свет невоору- жённым глазом или через лупу. Eсли эритроциты резус-положи- тельны, произойдёт их агглютинация. Отсутствие агглютинации свидетельствует о том, что испытуемая кровь резус-отрицательная. B контрольной пробирке агглютинация эритроцитов должна отсутствовать.

Непрямой антиглобулиновыи тест (реакция Кумбса)

Эта реакция наиболее чувствительна для выявления неполных антител к ауто- и изоантигенам эритроцитов. К ней, как правило, прибегают при возникновении трудностей в определении резус-при- надлежности крови, связанных с нечёткими результатами, полученными при других методах исследования. Реакция основана на использовании антиглобулиновой сыворотки.

При обработке резус-положительных эритроцитов неполными антителами анти-Rh наступает их обволакивание, сенсибилизация по отношению к антиглобулиновой сыворотке, которая агглютинирует сенсибилизированные эритроциты, поскольку имеет антитела к глобулинам.

В пробирку вносят антирезусную сыворотку и отмытые физиологическим раствором эритроциты, помещают на 1 ч в термостат при температуре 37 ?С, после чего эритроциты тщательно отмывают. Последующий этап реакции проводят на плоскости. Каплю взвеси эритроцитов смешивают с равным количеством антиглобулиновой сыворотки и учитывают результат. Наличие агглютинации - показатель того, что исследуемый образец крови резус-положительный. Если агглютинация отсутствует, то испытуемая кровь резус-отрицательная.

Реакция с анти-D-моноклональными антителами

На планшете смешивают большую каплю (0,1 мл) анти-D-монокло- нальных антител и маленькую каплю (0,01 мл) исследуемой крови.

За реакцией наблюдают в течение 3 мин. При смешивании анти- D-MKA с образцами резус-положительных эритроцитов отмечают быстро наступающую лепестковую агглютинацию. Если кровь резусотрицательная, агглютинация отсутствует.

Возможные ошибки

Чаще всего ошибки бывают следствием методических погрешностей при проведении исследования, в особенности при использовании конглютинационных методов. К ложным результатам могут привести неправильное соотношение между сывороткой и эритроцитами, преждевременная оценка результатов, оценка результатов по высыхающей капле, определение резус-фактора в гемолизированном и длительно хранящемся образце крови, а также использование неактивных, инфицированных и загнивших сывороток или сывороток с истекшим сроком годности.

Причиной ошибок могут быть биологические особенности испытуемой крови: снижение агглютинабельности резус-антигена при некоторых заболеваниях печени, почек, системы крови, а также неспе- цифическая агглютинация испытуемых эритроцитов. B случае сомнительных результатов исследование повторяют, применяя более активные антирезусные сыворотки.

Клиническое значение групповой дифференциации

Общие иммуногенетические аспекты

Групповые антигены и антитела крови имеют большое значение в физиологии и патологии человека. Прежде всего, надо иметь в виду, что антигены крови - маркёры генотипа каждого индивидуума. Этот факт имеет значение для плодовитости брака, течения и исхода беременности и здоровья новорождённого. Половые клетки соответственно генотипу имеют антигены, аналогичные групповым антигенам крови, а супруги часто отличаются по группе крови. Несовместимость супругов по системе резус-фактора - одна из наиболее частых причин иммунологического конфликта при беременности, приводящего к гибели плода или гемолитической болезни новорождённого.

B настоящее время всё больше появляется данных о статистически значимых связях групп крови с инфекционной и неинфекционной патологией человека. Наличие некоторых эритроцитарных и лей- коцитарных антигенов создаёт условия для большей вероятности некоторых заболеваний. B частности, известно, что язвенная болезнь наиболее часто развивается у пациентов с группой крови A(II), а наличие антигена HLA-B₁₈ предрасполагает к заболеванию гепатитом B, а если при этом у человека имеется ещё антиген HLA-B₅, то наиболее вероятно хроническое течение заболевания. Существует оп- ределённая связь иммунологической реактивности и лейкоцитарных групп по системе HLA. Например, организм людей, имеющих антиген HLA-B₈, более активно синтезирует любые антитела, а при наличии антигена HLA-B₃₅ особенно активно образует антитела к столбнячному анатоксину. Таких примеров много. Подобные данные имеют большое значение для определения групп риска в направленной диспансеризации, а также при профессиональном отборе.

StudFiles.ru

/ алгоритм 7 определение группы крови с цоликлонами

Определение группы крови с цоликлонами анти-А и анти-Б

1Вступительное слово: Мы проводим определение группы крови с цоликлонами в процедурном кабинете по назначению врача. На мне шапочка, очки, маска, халат, фартук, перчатки. Руки предварительно обработаны гигиеническим способом.

2 Оснащение:

1. Цоликлоны анти-А, анти-Б

2. Исследуемая кровь (пробирка)

3. Тарелка для определения группы крови.

4. Стерильные стеклянные палочки 2 шт ( в стакане, чашке Петри)

5. Изотонический раствор натрия хлорида

6. Стерильная пипетка 1 шт.

7. Стерильный капилляр с грушей.

8. Ёмкость с 3% раствором хлорамина.

3 Техника манипуляции:

1. Внести цоликлоны в отдельные лунки по одной большой капле.

2. Внести капилляром маленькие (0,01 мл) капли крови рядом с каплями цоликлонов, избегая контакта капилляра и крови.

3. Отдельными палочками смешать цоликлоны и кровь.

4. Покачивать тарелку, наблюдать агглютинацию 2,5 минуты.

5. Внести пипеткой в лунки, в которых произошла агглютинация по 1й капле физиологического раствора

6. Покачивать, наблюдать агглютинацию.

7. Форма ответа:

При определении группы крови с помощью цоликлонов …

1. Агглютинация не наблюдается ни в одной из лунок – первая группа

2. Агглютинация наблюдается с цоликлоном анти-А – вторая группа

3. Агглютинация наблюдается с цоликлоном анти-Б – третья группа

4. Агглютинация наблюдается с цоликлонами анти-А и анти-Б – четвертая группа

1. После проведения манипуляции все использованные предметы замачиваются в емкости с трехпроцентным раствором хлорамина.

4 Возможные ошибки:

Грубые ошибки:

1. Не использование средств защиты медработника.

2. Повторное использование палочек.

3. Перенос палочек, контактировавших с кровью над лотком с чистыми палочками.

4. Не соответствие картины агглютинации заключению о групповой принадлежности.

5. Не продезинфицированы предметы, контактировавшие с кровью.

Не грубые ошибки:

1. Время ожидания агглютинации менее 2.5 мин.

2. Не внесен физраствор в лунки, в которых произошла агглютинация.

3. Удерживание палочек за концы, а не за центр.

5 Критерии оценивания:

Сдал – отсутствие грубых ошибок, наличие не более двух не грубых ошибок.

Не сдал – наличие грубых ошибок, наличие более двух не грубых ошибок.

При совершении грубой ошибки преподаватель может попросить повторить соответствующий этап манипуляции. Если ошибка повторяется – не сдал. Допускается не более одного повторения.

StudFiles.ru

Группы крови системы аво

Таким образом:

В группе О (I) – в эритроцитах агглютиногенов нет, в сыворотке агглютинины α и β.

В группе А (II) – в эритроцитах агглютиноген А. в сыворотке агглютинин β.

В группе В (III) – в эритроцитах агглютиноген В, в сыворотке агглютинин α.

В группе АВ (IV) – в эритроцитах агглютиногена А и В, агглютининов в сыворотке нет.

В результате таких комбинаций агглютиногенов и аглютининов могут происходить следующие реакции.

Группа 0(I). Учитывая, что эритроциты не содержат агглютиногенов А и В, они не дают реакции агглютинации с плазмой крови человека других групп, так как отсутствует один из компонентов этой реакции. В плазме имеются оба агглютинина, поэтому она агглютинирует эритроциты всех прочих групп, содержащих всегда тот или иной агглютиноген.

Группа AB(IV). Эритроциты этой группы содержат оба агглютиногена и поэтому способны давать агглютинацию с плазмой всех остальных групп. В плазме же не содержится никаких агглютининов, поэтому реакции с эритроцитами других групп реакции агглютинации происходить не может. Группа 0 (I) и группа АВ(IV) по своим иммунологическим характеристикам являются диаметрально противоположными.

Группы А(II) и B(III) являются взаимно агглютинирующимися. Плазма одной группы дает агглютинацию с эритроцитами другой. С группами 0(I) и AB(IV) возникают следующие реакции. Эритроциты групп А(II) и В(III) агглютинируются плазмой группы 0(I), a плазма А(П) и В(Ш) групп дают агглютинацию с эритроцитами группы AB(IV).

К настоящему времени в системе АВО обнаружены разновидности классических антигенов А и В, а также другие антигены.

Антиген о

В начальный период считалось, что эритроциты первой группы не содержат агглютногенов, но сейчас установлено наличие специфической субстанции, названной фактором “О”. Он по своей природе является агглютиногеном. Он находится в эритроцитах групп О(I), А₂(II), A₂B(IV).

Субстанция Н.

Эритроциты всех групп содержат субстанцию Н, которая считается общим веществом-предшественником. Субстанция Н наиболее часто встречается у лиц с первой группой крови. В остальных группах она содержится в незначительном количестве.

Подтипы антигенов а и в

Избирательной адсорбцией установлено, что агглютиноген А не является однородным и имеется две основные разновидности – А₁ и А₂. Первый встречается в 88 % случаев, второй в 12 % . В соответствии с этим особенностям во второй и четвертой группах имеются подгруппы, из которых одна содержит А₁ а вторая – А₂ агглютиногены. Поэтому можно говорить о шести группах крови, но в клинической практике сохраняется делением людей на четыре группы. Выделение подгрупп имеет практическую значимость.

Дело в том, что агглютиногены А₁ и А₂ отличаются друг от друга по свойствам. Подтип А₂ имеет более низкую агглютинабельность, чем А₁. Поэтому А₁ называют сильным, а подтип А₂ – слабым. Кроме того, в плазме подгрупп А₂(II) и А₂В(IV) довольно часто содержится агглютинин, названный Ландштейнером экстрагглютинином α₁.Он дает агглютинацию только с эритроцитами А₁ и не дает агглютинации с эритроцитами А₂. В плазме подгрупп А₁(II) и А₁В(IV) довольно редко, но встречается экстраагглютинин α_2,не дающий агглютинацию с эритроцитами А_1,а агглютинирующий с эритроцитами А₂.

Существуют ещё подтипы А₃, А₄, А_z и др. Они встречаются редко, обладают более слабовыраженными агглютинабельными свойствами.

Существование подгрупп необходимо учитывать при определении группы крови. Подгруппы содержащие агглютиноген А₂ дают более позднюю и слабую агглютинацию. Поэтому можно допустить ошибку при определении группы крови.

Для агглютиногена В характерна большая однородность, но к настоящему времени выделены его редкие варианты: В_2,В₃, В_W и др. Клинического значения варианты агглютиногена В не имеют.

Весьма редко встречаются индивидуумы, группа крови которых отличается от обычной системы АВО.

В частности, выделяют дефектные группы крови, когда обычными методами не выявляются какой-либо из естественных агглютининов (А_о, В_о, О_α, О_β, О_оо)_. Еще более редким является “бомбейский” тип крови. В этом случае в эритроцитах отсутствуют антигены А, В, О, Н, а в плазме имеются агглютинины α и β, анти-О и анти-Н.

Кровяные химеры Кровяные химеры - это одновременное пребывание в организме человека эритроцитов, содержащих различный антигенный состав по системе АВО. Кровяной химеризм бывает врожденный и приобретенный. Врожденный встречается у близнецов. Приобретенный может появляться при пересадке аллогенного костного мозга, переливании неодногруппной крови. Существование кровяного химеризма следует учитывать при определении группы крови, т. к. при его наличии может получаться искаженный результат.

Распределение групп крови среди населения разных стран имеет некоторые различия, но в среднем считается, что людей 0(I) группы - 34 %, A(II) - 38 %, B(III) - 20 %, AB(IV) - 8 %.

СИСТЕМА АНТИГЕНОВ Rh-Нr

Увеличение трансфузионной активности в период, когда существование групп крови по системе АВО уже было известно, но не была еще открыта система ”резус”, сопровождалось ростом числа посттрансфузионных осложнений. Эти осложнения возникали, несмотря на переливание крови, совместимой по группам АВО. Причина этих реакций была определена Ландштейнером и Винером (1937-1938 г. г. ), а позже Левиным (1940). Они установили, что введение эритроцитов макак вида Macacus rhesus кроликам сопровождается выработкой у последних антител, которые агглютинируют в 100 % случаев эритроциты обезьян. Ввиду этого, указанные антитела назвали антителами антирезус. Затем было установлено, что сыворотка крови этих кроликов, содержащая антитела антирезус, агглютинирует эритроциты 85 % людей белой расы. Эритроциты 15 % людей этой расы такой сывороткой не агглютинируются. Из этого заключили, что у 85 % людей эритроциты содержат антиген “резус” (резус-фактор Rh), свойственный обезьянам Macacus rhesus. Такие люди были названы “резус-положительными”(Rh+). Люди, не содержащие в эритроцитах фактор “резус”, названы “резус-отрицательными”(Rh-).

Резус-фактор находится в эритроцитах людей независимо от возраста и пола и не связан с системой АВО. Резус-антиген выявляется у человеческого плода начиная с 5-8 недели и хорошо выражен у 3-4-месячного эмбриона. Кровь новорожденного имеет вполне четкую резус-принадлежность, которая является постоянной в течение всей жизни. При некоторых заболеваниях (нефрит, гепатит) титр резус-антигенов может снижаться почти до нуля, а по выздоровлении снова усиливаться.

Антигены резус являются липопротеидами. Они очень активны и способны вызвать образование иммунных антител, поэтому резус-фактор является сильным антигеном.

Главным отличием системы резус от системы АВО является то, что в крови людей содержатся только антигены этой системы, а антител по отношению к ним, подобных антителам α и β системы АВО, обычно в норме у людей не имеется. Выработка антител происходит у лиц с резус-отрицательной кровью при попадании в организм Rh-антигена. Выделены три вида антител: полные, неполные - агглютинирующие и неполные – блокирующие. Они способны фиксироваться к резус-положительным эритроцитам, не вызывая их склеивания.

Дальнейшие исследования привели к обнаружению в крови нового фактора Hr. В настоящее время практическое значение при переливании крови имеют 6 антигенов системы Rh-Hr: три из них являются разновидностями резус-фактора и три – разновидностями Hr фактора. Эти антигены обозначаются по номенклатуре Винера или по номенклатуре Фишера-Рейса. По номенклатуре Винера антигены резус-фактора записывают как - Rho, rh’, rh’’, антигены Hr-факторы – Hro, hr’, hr’’, а по номенклатуре Фишера-Рейса – соответственно D, C, E и d, c, e. Чаще пользуются номенклатурой Фишера-Рейса. Антигены передаются по наследству и в течение жизни не меняются. Они имеются не только в эритроцитах, но и в лейкоцитах, тромбоцитах, в жидкостях организма и околоплодных водах.

Образование резус антигенов контролируется тремя парами аллельных генов: Дд, Сс и Ее, которые расположены на двух хромосомах. Каждая хромосома способна нести только 3 гена из 6, прячем лишь 1 ген из каждой пары – Д или д, С или с, Е или е являются по отношению друг к другу аллельными. Поэтому эритроциты, не содержащие антигены С или Е, всегда содержат аллельные антигены с или соответственно е и наоборот. Указанные 6 антигенов резус встречаются в эритроцитах в виде одного из 18 возможных сочетаний. Каждый человек имеет 5, 4, 3 антигена резус в зависимости от количества генов, по которым он гомозигонет. Однако, генотипическая формула изображается шестью буквами, например сДЕ/СДе, обозначающими 3 гена резус, унаследованных с хромосомой одного из родителей, 3 – с хромосомы другого. В последнее время было доказано, что аллельного гена d не существует.

Учитывая, что антитела антирезус вырабатываются в организме только при введении антигенов, они обладают специфичностью, обусловленной антигенами, послужившими причиной изосенсибилизации.

Значение антигенов системы резус в клинической практике неодинаково. Наиболее важными из них являются 3 антигена: Rho (D), rh’(С), rh’’(E), обладающие наибольшей иммунной активностью. Установлено, что у резус-отрицательных лиц в результате переливания им резус-положительной крови или повторных беременностей резус-положительным плодом могут появляться резус-антитела. На однократную трансфузию 400 мл резус-положительной крови около 50 % резус-отрицательных реципиентов реагируют выработкой резус-антител. При повторном переливании резус-положительной крови таким лицам возникает гемолиз эритроцитов. Более 90 % посттрансфузионных осложнений обусловленых резус-несовместимостью донора и реципиента, связаны с разновидностью антигена Rh₀(D). Людей, в эритроцитах которых присутствует антиген Rh₀ (D), относятся к резус-положительным, а людей, эритроциты которых лишены этого антигена – к резус-отрицательным. Иначе подходят к оценке резус принадлежности лиц, являющихся донорами.

В том случае, если эритроциты донора содержат один из антигенов Rh0,rh’(С), rh’’(Е) его считают резус-положительным.

Резус-отрицательными донорами называют лишь тех лиц, в эритроцитах которых нет ни одного из вышеуказанных антигенов. Такой подход позволяет исключить возможность сенсибилизации реципиента к любому из трех основных антигенов: Rho(D), rh’(C), rh’’(E). Таким образом, некоторые люди могут быть резус-отрицательными реципиентами и резус-положительными донорами.

Частота выявления резус-фактора Rho(D) среди представителей различных рас неодинакова. Среди европейского населения резус-отрицательные лица составляют 15 %, а среди монголоидной расы – около 0,5 %.

Из антигенов Hr наиболее частой причиной иммунизации оказывается антиген hr’(с). Антиген hr’’(e) более слабый антиген. Все лица с резус-отрицательной кровью одновременно являются Hr-положительными, так как имеют антиген hr(c). Среди имеющих резус-положительную кровь большинство (около 81 %) имеют антиген hr’(c) и будут также Hr-положительными, около 19 % лиц с резус-положительной кровью не имеют антигена hr’(c) и должны считаться Hr-отрицательнысми.

Опасность иммунизации по антигену hr’(c) заставляет предостерегаться от трансфузий резус-отрицательной крови реципиентам с резус-положительной кровью или вообще без определения резус принадлежности больного, так как можно вызвать иммунизацию или посттрансфузионное осложнение по антигену hr’(c), если больной окажется Hr-отрицательным. При переливании крови, строго одноименной по резус-фактору этой опасности практически нет.

StudFiles.ru

Методика определения групп крови

Совместимость групп крови

В связи с большой степенью разведения вливаемой боль­ному крови донора, вводимая плазма не оказывает ника­кого влияния на эритроциты реципиента. Только эритро­циты донора могут агглютинироваться сывороткой реци­пиента, а не наоборот — это правило Оттенберга. Однако при большом переливании крови от универсального доно­ра 0(I) резко обескровленному больному, да еще в случае высокого титра агглютининов переливаемой крови (1:200 и выше) это правило может подвести больного и врача. Перелитая плазма недостаточно будет разведена плазмой больного и может вызвать у него гемолиз эритроцитов, то есть произойдет обратная агглютинация и обратный гемолиз и будут агглютинироваться не влитые эритроциты, а эритроциты реципиента, что вызовет гемолитический шок.

Стандартные сыворотки определяют специфический агглютиноген, а стандартные эритроциты — агглютинин.

Итак, определение группы крови можно производить по стандартным сывороткам и стандартным эритроцитам.

Обычно пользуются стандартными сыворотками 0(I), А(II), В(III), AB(IV).

Признаки пригодности сыворотки:

■ она должна быть специфической, то есть содержать строго определенные агглютинины — 1, В;

■ сыворотка должна быть активной и иметь титр 1:32 для эритроцитов А1 и В и не менее 1:16 для эритро­цитов А2;

■ сыворотка должна быть светлой и прозрачной;

■ в сыворотке не должно быть признаков гниения;

■ сыворотка должна иметь паспортизацию: группу, титр, срок годности, серию, место приготовления.

Помещение, где проводится определение группы кро­ви, должно быть светлым, с температурой от 15 до 25 оС.

На тарелку или предметное стекло наносятся пипет­ками (разными!) по 1-й крупной капле сыворотки 0(I), А(II), В(Ш). Заметив время, чистой стеклянной палоч­кой или чистым углом предметного стекла капли сыво­роток соединяются с каплями крови. Определение длит­ся 5 минут, покачивая тарелку, затем к каждой смеси капель добавляют по 1-й капле физраствора и оценивают результаты. Лучше, если сыворотка будет 2-х различных серий. Результаты групп крови должны совпадать в обе­их сериях сыворотки.

Оценка результатов изогемагглютинации:

■ при положительной реакции в смеси появляются мельчайшие красные зернышки склеивающихся эрит­роцитов. Зернышки сливаются в более крупные зер­на, а последние — в хлопья. Сыворотка почти обесц­вечивается;

■ при отрицательной реакции смесь в течение 5 мин ос­тается равномерно окрашенной в розовый цвет и ни­каких зернышек не обнаруживается;

■ при работе с 3 сыворотками групп 0(I), А(П), В(Ш) возможны 4 комбинации реакций:

— если все 3 сыворотки дали отрицательную реакцию, то есть смесь равномерно окрашена в розовый цвет — это 0(I) группа крови;

— если отрицательную реакцию дала только сыворот­ка группы А(П), а сыворотки 0(I) и В(Ш) дали поло­жительную реакцию, то есть появились зерна — это А(II) группа крови;

— сыворотка группы В(П) дала отрицательную реак­цию, а сыворотки группы 0(I) и А(П) дали положи­тельную — это В(Ш) группа крови.

— все 3 сыворотки дали положительные реакции — испытуемая кровь AB(IV) группы. В этом случае про­водится исследование с сывороткой AB(IV) группы.

Обратите внимание!Капли исследуемой крови дол­жны быть в 5-10 раз меньше капель сыворотки.

Ошибки изогемагглютинации.

Невыполнение агглютинации, где она должна быть, и наличие агглютинации, где ее быть не должно. Это мо­жет быть при слабом титре сыворотки плюс плохая агг­лютинация эритроцитов.

Наличие агглютинации, где ее быть не должно, — это псевдоагглютинация, когда кучки эритроцитов образу­ют «монетные столбики». Покачивание тарелки или до­бавление физраствора их разрушают.

Панагглютинация, когда сыворотка склеивает все эрит­роциты, в том числе и своей группы крови. К 5-й минуте признаки агглютинации исчезают.

Имеется еще так называемая холодовая панагглютинация, когда склеивание эритроцитов происходит из-за низкой температуры воздуха (ниже 15 °С) в по­мещении.

Во всех этих случаях проводят либо повторную реак­цию, либо по стандартным эритроцитам.

Лекция 17. Резус-фактор

studopedia.ru